【新知】鎖定"毒源"的利器：基因組時(shí)代的病原檢測(cè)技術(shù)

經(jīng)過(guò)一整年嚴(yán)格的新冠疫情防控，時(shí)間再次帶著我們進(jìn)入嚴(yán)冬，全國(guó)多個(gè)城市又出現(xiàn)了小范圍疫情。與去年此時(shí)不同的是，我們已經(jīng)掌握了更多的防控信息和技術(shù)，也有了一套較為成熟的應(yīng)對(duì)方案，包括北京、大連、沈陽(yáng)等城市在內(nèi)，各地均能夠在發(fā)現(xiàn)疫情后短時(shí)間內(nèi)完成流調(diào)排查，為數(shù)千萬(wàn)市民進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

新型冠狀病毒的全球大流行是很多人第一次親身經(jīng)歷重大疫情。其實(shí)自人類文明誕生以來(lái)，傳染病就如影隨形，和人類相伴。人類歷史上數(shù)次爆發(fā)重大疫情，瘟疫造成的死亡數(shù)量堪比戰(zhàn)爭(zhēng)。傳染病不僅危害人類的健康，還對(duì)政治、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、軍事產(chǎn)生重要的影響。從希臘文明的隕落到基督教的興起，從阿茲特克帝國(guó)的衰亡到第一次世界大戰(zhàn)的終戰(zhàn)，其間都有傳染病的身影。

盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，傳染病的發(fā)病率和病死率有了顯著的下降，但仍然是人類的重大挑戰(zhàn)。比爾蓋茨在2015年的一次演講時(shí)說(shuō)道：“在未來(lái)幾十年，如果說(shuō)有什么東西能夠殺死上千萬(wàn)人，最有可能是一種高度傳染性的病毒。”鑒于此，世界衛(wèi)生組織號(hào)召全世界加強(qiáng)對(duì)傳染病的研究，以應(yīng)對(duì)可能出現(xiàn)的暴發(fā)流行。嚴(yán)格準(zhǔn)確的病原檢測(cè)技術(shù)，正是重要的應(yīng)對(duì)手段之一。檢測(cè)技術(shù)如何幫助防疫人員們變身“福爾摩斯”?病毒溯源的過(guò)程又是什么樣的?

未雨綢繆的前瞻性研究

從2015年開始，世界衛(wèi)生組織每年都列出號(hào)召全球優(yōu)先研究的傳染病清單。從2018年開始，“X疾病”一次開始出現(xiàn)在這份清單中。“X疾病”代表一種未知病原體造成的嚴(yán)重的流行病，可以是自然發(fā)生的，也可以是人為故意的，有可能在任何的時(shí)間，由多種來(lái)源觸發(fā)，或許會(huì)奪去數(shù)百萬(wàn)人的生命。這種“X疾病”代表了未來(lái)的一種可能——可能是一種未知的傳染病。

目前，已經(jīng)知道的病毒有很多。據(jù)科學(xué)家估計(jì)，在哺乳動(dòng)物和鳥類當(dāng)中有100多萬(wàn)種病毒，而其中至少有60萬(wàn)種以上可以感染人類。但目前已知可感染人類的病毒還不到300種，“盡管大家知道病毒是潛在的威脅，但依然無(wú)法預(yù)測(cè)下一種新的病毒在何時(shí)何地出現(xiàn)，或者來(lái)自哪一種物種。”因此，加強(qiáng)病原檢測(cè)鑒定技術(shù)以及藥物疫苗的研究，是應(yīng)對(duì)未來(lái)可能出現(xiàn)的新發(fā)突發(fā)傳染病挑戰(zhàn)的一項(xiàng)重要舉措，這其中病原檢測(cè)技術(shù)又首當(dāng)其沖。

目前病原的檢測(cè)技術(shù)面臨著眾多的挑戰(zhàn)。一是病原的種類非常多。目前可以引起傳染病的病原包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等很多種類。二是病原體的變異非常頻繁，可以通過(guò)突變來(lái)逃逸免疫，引起新的流行，也可以逃避原有疫苗的作用。動(dòng)物來(lái)源的病原識(shí)別也比較困難。三是可能存在著多種病原體共感染的現(xiàn)象，為病原的鑒定帶來(lái)了困難。此外，臨床樣本中病原的含量可能比較低，檢測(cè)也比較困難。

近百年以來(lái)，隨著微生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)病原體的檢測(cè)已經(jīng)建立了多種方法。以病毒檢測(cè)為例，我們可以檢測(cè)分離的整體病毒顆粒，也可以對(duì)其抗原成份進(jìn)行檢測(cè)，還可以檢測(cè)病毒感染人體產(chǎn)生的抗體，對(duì)病毒的感染進(jìn)行診斷。另外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，核酸檢測(cè)成為代表性的技術(shù)方法。這些技術(shù)的用途比較廣泛，但是還存在一些不足。比如病毒顆粒分離培養(yǎng)的方法，它的技術(shù)難度比較大、比較耗時(shí)，檢出率低，難以普及。抗原抗體的檢測(cè)方法容易受到干擾，抗體的檢測(cè)存在窗口期的問(wèn)題，抗原的檢測(cè)存在靈敏度的問(wèn)題。

核酸檢測(cè)是目前應(yīng)用比較廣泛的，最具代表性的是PCR方法。這種方法通過(guò)對(duì)一個(gè)病毒的基因片段進(jìn)行上億次的擴(kuò)增，使痕量的病毒核酸得以檢測(cè)，所以在臨床上得到了比較多的應(yīng)用。但PCR的方法受制于對(duì)病毒序列的依賴，即必須先要知道病毒的基因序列才能設(shè)計(jì)出PCR的檢測(cè)方法。

“一錘定音”：宏基因組測(cè)序技術(shù)

近年來(lái)，高通量的宏基因組測(cè)序技術(shù)逐漸得到了應(yīng)用，并且發(fā)揮了重要的作用，特別是在病原體的診斷當(dāng)中，發(fā)揮“一錘定音”的作用。宏基因組技術(shù)用于病原體的檢測(cè)有很多的優(yōu)勢(shì)。一是和PCR這些序列依賴的方法相比，它是非序列依賴性的，所以不需要預(yù)知任何病原體序列信息就可以進(jìn)行檢測(cè)。二是病原體檢測(cè)的靈敏度比較高。三是檢測(cè)的通量高，可以同時(shí)檢測(cè)上萬(wàn)種病原微生物的物種，也可以發(fā)現(xiàn)可能的共感染。四是檢測(cè)效能高，通過(guò)一次測(cè)序就可以拼接出病原體的基因組序列，不需要再重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。五是解析的深度深，可以同時(shí)分析病原體的變異和耐藥等情況。最后，它獲取的信息全，除了獲取病原的序列之外，還可以同時(shí)獲取宿主的基因組和轉(zhuǎn)錄組的信息，為預(yù)警和臨床診療提供基礎(chǔ)。

宏基因組的病原體檢測(cè)技術(shù)在近十幾年以來(lái)，在新病原的發(fā)現(xiàn)當(dāng)中發(fā)揮了重要的作用。首先就是新冠病毒的發(fā)現(xiàn)和確癥。2019年12月，武漢出現(xiàn)了不明原因的肺炎。由于偶然的機(jī)會(huì)，我們的合作伙伴對(duì)來(lái)自武漢的一例不明原因肺炎的肺泡灌洗液的樣本進(jìn)行了深入的測(cè)序，對(duì)這個(gè)數(shù)據(jù)分析后我們發(fā)現(xiàn)里面存在著一種新的冠狀病毒，并且拼接出了它的全基因組序列。這個(gè)序列顯示，它和既有的SARS病毒和MERS病毒(中東呼吸綜合癥冠狀病毒)，序列是完全不同的。這說(shuō)明存在一種全新的冠狀病毒，可能和出現(xiàn)的肺炎病例有關(guān)系。

接下來(lái)要做的是確證是不是這一新的冠狀病毒引起了這些肺炎的病例。所以我們從病人身上收集了更多肺泡灌洗液、咽拭子、痰液等樣本，把呼吸道樣本進(jìn)行前處理，提取核酸之后來(lái)建立測(cè)序文庫(kù)。對(duì)樣本上機(jī)測(cè)序之后進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，首先去除人類基因組的污染，把剩余的序列和公開的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒別里面存在的微生物的物種，從而確定病原。

但是對(duì)于新病原的鑒定來(lái)講，光靠測(cè)序還不夠，還需要用其他的方法進(jìn)行鑒定。我們首先對(duì)5例樣本進(jìn)行檢測(cè)。可以看到，5個(gè)病例的呼吸道樣本當(dāng)中都可以檢測(cè)出一種新的冠狀病毒的基因。對(duì)它進(jìn)行基因譜系的分析，就像畫家譜一樣的，和其他已經(jīng)知道的冠狀病毒去比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)冠狀病毒是一個(gè)全新的病毒。而且我們也推測(cè)，它和SRAS病毒相似，也可能使用ACE2作為受體。

在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們很快分離出了病毒，通過(guò)電子顯微鏡可以看出，它是典型的冠狀病毒的形態(tài)，上面有像皇冠一樣的特征性結(jié)構(gòu)。另外，我們也做了免疫學(xué)的實(shí)驗(yàn)。因?yàn)椴∪烁腥静《局髸?huì)產(chǎn)生抗體，我們利用這些抗體與分離的病毒做免疫熒光可以看到陽(yáng)性的信號(hào)。所以結(jié)合我們的宏基因組的分析、PCR的檢測(cè)、病毒的分離、免疫熒光的鑒定等等，提示這是一種新的冠狀病毒，引起了不明原因的肺炎。

因?yàn)橛辛诉@樣的方法，我們和曹彬教授、黃朝林教授等合作，很快對(duì)早期的病例進(jìn)行診斷，使我們能夠很快報(bào)道這些病例的臨床特征，而且也對(duì)這些病例的來(lái)源進(jìn)行了追溯，為疫情的預(yù)警和臨床診療方案的制定提供了重要的基礎(chǔ)。我們也通過(guò)GISAID的平臺(tái)，代表國(guó)家最早向全球共享了病毒全基因組的序列。病原鑒定工作得到了世界衛(wèi)生組織的高度評(píng)價(jià)，譚德賽總干事指出：“中國(guó)在創(chuàng)記錄的時(shí)間內(nèi)識(shí)別出病原體，并立即進(jìn)行分享，為迅速研發(fā)診斷工具作出了貢獻(xiàn)。”

在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們也研發(fā)了病毒核酸的檢測(cè)方法，向全國(guó)推廣應(yīng)用。2020年1月11日，這一方法在武漢現(xiàn)場(chǎng)通過(guò)了國(guó)家衛(wèi)生健康委科教司組織的驗(yàn)證，之后獲得了產(chǎn)品證書。

另外，針對(duì)PCR檢測(cè)方法對(duì)咽拭子檢出率不到50%的情況，我們也提出結(jié)合IgM抗體的檢測(cè)，可以大幅提升病毒感染的診斷率，我們也獲得了兩項(xiàng)診斷產(chǎn)品的證書。

準(zhǔn)確追蹤疫情的重要工具

在去年三四月后全國(guó)的疫情逐漸歸于穩(wěn)定平靜。北京在6月10日之前已經(jīng)有連續(xù)56天沒(méi)有本地新發(fā)的新冠肺炎病例。6月11日卻突然發(fā)現(xiàn)一個(gè)病例，引出了新一波小范圍疫情。這次疫情通過(guò)全市的篩查和防控措施的實(shí)施等一系列的努力，到8月初被成功終止，有力地維護(hù)了首都的安全。但是在疫情應(yīng)對(duì)的過(guò)程中，有這樣幾個(gè)為題需要準(zhǔn)確回答：疫情是什么時(shí)候發(fā)生的，是從哪兒來(lái)的，源頭在哪里，是怎么傳播的等等，這樣才能為此后防控提供有效的指導(dǎo)。

6月11日的病例發(fā)現(xiàn)以后，通過(guò)對(duì)患者軌跡的追溯，北京有關(guān)部門對(duì)他的密切接觸者和接觸的環(huán)境樣本進(jìn)行了檢測(cè)。由此發(fā)現(xiàn)了兩份來(lái)自新發(fā)地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的樣本是新冠病毒的核酸檢測(cè)陽(yáng)性。在這個(gè)基礎(chǔ)上，對(duì)新發(fā)地進(jìn)行了擴(kuò)大檢測(cè)，在538份樣本當(dāng)中檢測(cè)出45份是陽(yáng)性。這說(shuō)明新發(fā)地是疫情發(fā)生過(guò)程中的重點(diǎn)場(chǎng)所。因此，北京市有關(guān)部門在6月13日果斷的關(guān)閉了新發(fā)地市場(chǎng)。市場(chǎng)關(guān)閉以后，在全市采取了嚴(yán)格的管控措施，病例的數(shù)量迅速下降，到7月初，基本上沒(méi)有新發(fā)的病例，疫情得到了有效的控制。

新發(fā)地是北京最大的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，有超過(guò)5千以上的攤位，每天的客流量有5萬(wàn)以上，所以它的疫情備受重視。北京市有關(guān)部門對(duì)新發(fā)地的員工進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)在3300多位員工當(dāng)中有169位是新冠病毒核酸陽(yáng)性。

與此同時(shí)，流調(diào)結(jié)果顯示，在關(guān)閉市場(chǎng)之前，從5月底到關(guān)閉市場(chǎng)之前的10多天中，有55萬(wàn)顧客到訪過(guò)新發(fā)地。通過(guò)對(duì)他們的追蹤，發(fā)現(xiàn)有103例是新冠病毒陽(yáng)性。在這個(gè)基礎(chǔ)上，對(duì)全市1000萬(wàn)人進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)96人是陽(yáng)性。截止到7月10日，總共發(fā)現(xiàn)了368名感染者，距離6月11日發(fā)現(xiàn)病例剛好過(guò)去了一個(gè)月的時(shí)間。

確定感染路徑之后就有這么幾個(gè)問(wèn)題需要解答。首先，病毒是什么時(shí)候進(jìn)入新發(fā)地市場(chǎng)的?我們將所有的病例做了一個(gè)時(shí)間的分布。由于新冠病毒感染的潛伏期一般在14天以內(nèi)，所以從6月初的病例往前推，應(yīng)該病毒是在5月底侵入到了市場(chǎng)中。不論是員工、顧客，還是沒(méi)有市場(chǎng)接觸史的感染者，他們基本上都和新發(fā)地有直接或間接的關(guān)系，所以新發(fā)地是這次疫情唯一的來(lái)源。

確定了新發(fā)地是疫情的來(lái)源，那么它的源頭又在哪里?北京市有關(guān)部門對(duì)新發(fā)地內(nèi)環(huán)境樣本和從業(yè)人員進(jìn)行了檢測(cè)，包括交易大廳的負(fù)一層，檢測(cè)了584個(gè)人，其中有122人是陽(yáng)性，陽(yáng)性率高達(dá)20.9%。市場(chǎng)上的其他廳檢測(cè)了2727人，47人陽(yáng)性，陽(yáng)性率只有1.7%。所以交易大廳引起了高度的關(guān)注。交易大廳分為海鮮區(qū)、展柜區(qū)、豆制品區(qū)和牛羊肉區(qū)，其中海鮮區(qū)的檢出率最高，高達(dá)50%以上。

攤位的環(huán)境樣本和人員樣本的監(jiān)測(cè)結(jié)果還顯示，有14個(gè)攤位的工作人員和環(huán)境樣本都是陽(yáng)性的。因?yàn)楸本┊?dāng)時(shí)沒(méi)有疫情傳入，而且在這之前也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感染者，所以病毒極有可能是從新發(fā)地的環(huán)境當(dāng)中來(lái)的，所以這14個(gè)攤位被列為重點(diǎn)研究對(duì)象。對(duì)5月下旬到6月12日之前到訪的這14個(gè)攤位的3200多名顧客進(jìn)行了抗體的檢測(cè)后，我們發(fā)現(xiàn)有5位顧客的抗體是陽(yáng)性的，而恰好這5位顧客在5月30日和31日都到訪過(guò)S14這個(gè)攤位，而且這5個(gè)人和他的密切接觸者，在14天內(nèi)都沒(méi)有到訪過(guò)其他的中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，也沒(méi)有接觸過(guò)來(lái)自中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的人員，基本可以排除是外來(lái)的感染。

在此基礎(chǔ)上，對(duì)這些病例到訪的攤位進(jìn)行了研究，顯示S14攤位感染的比例是最高的，7個(gè)員工全部都感染了，而且抗體的陽(yáng)性率也是最高的。另外，從發(fā)病的時(shí)間來(lái)看，他們的發(fā)病時(shí)間在發(fā)病的感染者當(dāng)中也是比較早的。這個(gè)攤位的所有工作人員14天以內(nèi)都沒(méi)有到訪過(guò)其他的中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，也沒(méi)有接觸過(guò)來(lái)自中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的人員。據(jù)此可以判斷，S14攤位很可能就是感染的源頭。

形成檢測(cè)技術(shù)體系，更快更便宜更智能

鎖定了S14攤位，且可能是環(huán)境樣本造成暴露，那么病毒又是從哪兒來(lái)的呢?結(jié)合流行病學(xué)和測(cè)序技術(shù)的基因組流行病學(xué)，是追蹤傳染的來(lái)源的一個(gè)非常有用的工具。但在環(huán)境樣本中，病毒的含量是特別低的，樣本量又非常大，通過(guò)高通量測(cè)序有一定困難。在北京大學(xué)謝曉亮教授的支持下，清華大學(xué)王建教授的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于SHERRY的Minerva技術(shù)。通過(guò)這個(gè)技術(shù)可以把文庫(kù)構(gòu)建的速度縮短到5個(gè)小時(shí)以內(nèi)，測(cè)序的速度更加快捷;另外，還能建立了基因組富集的方法，使載量很低的樣本能夠得到有效測(cè)序。

基于這樣一個(gè)技術(shù)體系，我們通過(guò)合作，對(duì)110份新冠病毒陽(yáng)性的感染者和環(huán)境樣本進(jìn)行了病毒基因組測(cè)序，得到了72條高質(zhì)量的全基因組序列，包括56條感染者的基因組序列和16條環(huán)境樣本的基因組序列。通過(guò)這樣的方法我們也得到了環(huán)境樣本的全序列。對(duì)這個(gè)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，每一條序列上都有8個(gè)突變的位點(diǎn)，有53%的序列只有這8個(gè)突變，其余的序列還有其他一些突變。這就說(shuō)明這些突變是單一的來(lái)源，從病毒基因組的層面也證明新發(fā)地的感染是單一來(lái)源的。

這個(gè)過(guò)程是對(duì)病毒進(jìn)化樹分析的前提，之后的工作就像我們排家譜一樣，看看那些病毒系列的相似度更高。新發(fā)地發(fā)生疫情時(shí)，在吉林和黑龍江也有疫情，比對(duì)后我們發(fā)現(xiàn)，來(lái)自北京新發(fā)地的病毒序列和2020年3月前在京流行的毒株、彼時(shí)在黑龍江和吉林流行的毒株都不一樣，卻和在國(guó)外，特別是在歐洲等地流行的毒株突變位點(diǎn)是相同的。這就說(shuō)明這個(gè)毒株來(lái)自于境外。

那么怎么從境外傳進(jìn)來(lái)的呢?除了S14攤位，市場(chǎng)只有一個(gè)攤位也是售賣三文魚的，這個(gè)攤位沒(méi)有病例，而S14攤位是自己在市場(chǎng)內(nèi)切割，其員工全部感染。且S14所賣的商品中只有三文魚是從境外進(jìn)口的。

為了進(jìn)一步追溯感染的來(lái)源，我們對(duì)三文魚進(jìn)行了檢測(cè)。S14在5月30日曾經(jīng)購(gòu)入了一家公司從境外進(jìn)口的三文魚，但由于這批三文魚已經(jīng)賣完，所以很遺憾，我們未能得到魚的樣本。但是我們從一份沒(méi)有開封的魚體表面，通過(guò)測(cè)序得到了覆蓋55%的基因組序列。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)這個(gè)序列，和我們前面在新發(fā)地測(cè)得的流行毒株的序列是一致的，也有這些相同的基因突變的位點(diǎn)。所以這就提示，盡管我們因?yàn)闃颖驹驔](méi)有分離到這個(gè)病毒，無(wú)法證明它的感染性，但是可以提示進(jìn)口的冷鏈?zhǔn)称房赡苁遣《镜膫鞑ポd體。這也是第一次提出了這樣的一個(gè)發(fā)現(xiàn)。

而市場(chǎng)內(nèi)所有的三文魚的供應(yīng)商倉(cāng)庫(kù)的3000多份三文魚經(jīng)過(guò)檢測(cè)后，有6份結(jié)果是陽(yáng)性，而其中5份是來(lái)自X公司。隨后在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)也都發(fā)現(xiàn)在冷鏈?zhǔn)称繁砻鏅z測(cè)出新冠病毒核酸，并且中國(guó)疾控中心在青島在冷鏈?zhǔn)称返谋砻娣蛛x出新冠病毒。所以這也從另一個(gè)方面提示冷鏈?zhǔn)称吩谛鹿诓《緜鞑ブ械闹匾浴?/p>

通過(guò)疫情初期和北京這次小范圍疫情就能看出，基于宏基因組檢測(cè)技術(shù)對(duì)于病原的發(fā)現(xiàn)和溯源以及追蹤具有非常重要的作用。所以，未來(lái)要針對(duì)臨床和疾控的需求，使測(cè)序的速度更快、成本更低，通過(guò)自動(dòng)化、智能化的技術(shù)，使它的使用更加便捷，而且能夠適應(yīng)變異和耐藥分析等多樣化功能的需求，從而能實(shí)現(xiàn)走向普及應(yīng)用，為隨時(shí)應(yīng)對(duì)可能發(fā)生的疫情提供有力的支撐。【責(zé)任編輯/周末】

(注：王健偉，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院副院校長(zhǎng)，本文根據(jù)王建偉教授在未來(lái)科學(xué)大獎(jiǎng)周演講內(nèi)容整理而來(lái)，有刪改)

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